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作者：陳鈺婷/有勁生物科技

在定量上，digital PCR (dPCR) 與real-time PCR (qPCR) 間最大的不同，是digital PCR利用chip或droplet的形式將需要定量的樣品分隔成大量的小分隔，將稀釋的樣品侷限在各分隔中來進行反應，對個別分隔偵測樣品存在與否來決定樣品分子的數量。目前dPCR已被廣泛用於基因序列變異的偵測，如copy number variants或點突變。在分子診斷上，dPCR被應用於癌症學、傳染病學、胎兒基因篩檢及移植排斥反應的預測等。

Rare sequence mutation、copy number數量的偵測為dPCR的優勢；由於dPCR是藉由單一分隔的陰性或陽性訊號來判別，因此不會受限於PCR增幅效應的影響，不需標準曲線來推測分子數目，屬於絕對定量，對於微量樣品的偵測相當有利；但微量定量實驗中，若出現primer設計不良或樣品污染的情形造成false-positive，則會對實驗結果造成極大的誤差。

Rare Variants

若利用dPCR來偵測rare variants，可能發生困難的原因有下面幾個情況：一為dPCR對結果的高度敏銳性並無法避免實驗可能出現的cross-reactivity (fig. 1)；用以偵測mutant的引子有可能以較低的增幅偵測到wild type的訊號，若要讓wild type及mutant間的差異顯著到能夠被區分，需要調整PCR的條件或重新設計更為適用的引子對。另一個狀況，雖然dPCR有能力從10000個wild type序列中找到一個SNP，但也意味著需要50000個gene copy數來保證樣品中含有至少一個目標SNP的可能性達到99%，而這樣的樣品濃度在定量上很可能過高，而且在部分案例也很難收集到如此數量的樣本。

Fig. 1 在QX100 droplet digital PCR (Bio-Rad) 上觀察到的cross-reactivity。

Bias

大部分以PCR為基礎的定量方法，設計不良的實驗條件很容易造成非專一性放大而高估，但dPCR一般比較不容易過度高估樣品；理論上，除非DNA在分隔前發生denature的現象，造成比實際分子數目多的template分佈，dPCR的檢測結果不容易出現高估的情形；如此情形下也頂多出現原濃度兩倍的高估量。然而肇因於dPCR只會計算有訊號的分隔單位，低估是更可能發生的；當分隔中包含有template，卻沒有被順利放大，這樣的情況稱之為 ”molecular dropout” ；在digital LAMP或定量RNA 樣品時特別容易發生，若template是plasmid supercoid之類難以被複製或DNA受損的情形下，molecular dropout也有可能發生；若樣品中存在有抑制物 (inhibitor) 也會壓低定量結果；為了避免抑制物影響結果的判讀，在定量過程中設置internal positive control就變得很重要。

由於dPCR基礎在於目標的隨機分佈，所以樣品非均質化或template間的連鎖也會造成數量的低估。另一個dPCR的評估基礎在於假設每個分隔的容積都是固定的，且只包含一個template (fig. 2)，但這在技術上有相當的難度，只能假設分隔容積造成的誤差在其他操作因素的干預下可忽略；若個別儀器能在每次分析提供相關數據做為品質參數，或許能使定量結果更具有可信度。

Fig. 2 分隔容積的不一致造成的樣品分佈不一致，導致定量被低估的情形。

參考文獻： J. F. Huggett, S. Cowen, and C. A. Foy. Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clin. Chem. (2015) 61(1) 79–88.