作者：洪郁豪/有勁生物科技
Illumina公司靠著Reversible Terminator–Based Sequence by Synthesis (SBS)這個專利系統技術，每年推陳出新許多不同的次世代定序平台。這套原由劍橋大學科學家Shankar Balasubramanian博士與David Klenerman博士所研究開發的系統，在2006年推出第一代定序儀Solexa -Genome Analyzer後隔年便為Illumina收購。這套定序系統實際上囊括了許多特別的技術(詳見下方影片一的官方3D模擬影片)，而將其中各項技術成功組合起來，才是Illumina技術得以在定序市場佔有龍頭地位的主因1。
影片一、Illumina Reversible Terminator–Based Sequence by Synthesis 原理介紹
影片來源：Illumina, Inc. (2016 Oct 5). Illumina Sequencing by Synthesis. [Video file]
舉例而言，Dye-terminators是其中一項重要技術，這讓每個化學循環只能定序一個帶有螢光的核苷酸，於定序完切除螢光後，才會在下個循環接著定序次一個帶有螢光的核苷酸。Bridge PCR (橋式聚合酶鏈鎖反應)技術則是把每一條DNA分子固定在定序晶片上，於原地進行數量增幅，以便放大定序時的螢光訊號，提高偵測靈敏度與正確性。此外，隨著視覺檢測相機 (CCD camera)技術的日新月異，Illumina也在每年新定序機種的發表中推陳出新。
在此，筆者先就Illumina的「螢光辨識轉換核苷酸定序系統」做個簡單介紹3。最初的機台GAIIx、Hiseq與Miseq系列如圖一 (左)所示，是採用4-Channel Chemistry (四頻螢光化學)變換邏輯的定序系統。四種核苷酸各帶著不同色螢光，總共四種顏色；定序機器則搭載著紅綠兩種不同波長的雷射，分別激發所對應的螢光，經由切換四種濾光片(filter)後接收訊號，然後根據定序晶片上每個 flowcell被定位的叢集 (cluster)座標軸，依序記錄所讀取到的螢光對應序列，完成定序工作。
圖一、Illumina於不同平台所使用的三類型核苷酸轉換螢光變換邏輯
由左至右分別為四頻、雙頻、單頻螢光化學變換邏輯示意圖。(圖片來源：Illumina, Inc. (2016). Illumina Two-Channel SBS Sequencing Technology: High data accuracy with faster data generation.)
2014年推出的NextSeq 500是Illumina改採新一代螢光辨識轉換核苷酸邏輯，亦即2-Channel Chemistry (雙頻螢光化學)後的第一個定序平台4，這項技術也被應用在後續推出的平台上，例如：MiniSeq、NovaSeq。參考上圖一(中)所示，雙頻螢光定序系統由核苷酸攜帶螢光的想法雖然被保留下來，但只有T、C維持個別攜帶一種螢光，G完全不帶螢光，A則同時攜帶前述T與C的兩種螢光。因此，雙頻螢光定序雖依舊搭載紅綠兩種光源，卻僅需兩種螢光濾光片接收訊號，省去轉換濾光片的時間、也省去一半的照片空間，因此提升了定序速度，也減少了程式運算的時間。從邏輯上來看，紅綠兩張照片上都有出現螢光訊號的為A；叢集座標上已被定義但兩張照片都未出現螢光訊號者為G。
然而這樣的改變也有缺點，由於G不帶訊號故必須依賴上下游其他核苷酸的螢光訊號來確立叢集的存在，並且需用不顯色的黑色背景做出區隔，因此在定序一開始處若出現連續G序列的狀況，就有可能造成叢集不存在的誤判。同樣的，選擇Index(定序標籤)時也要注意，不可全部使用開頭連續為G的barcode序列4。另外，有人曾提出，在定序長度增加、定序品質自然逐漸下降的情況下， phasing (調整定相)所造成的雜色，在進行判讀時會有被誤判為A混色螢光的疑慮；不過這個問題在雙頻螢光定序新一代V2版本試劑推出後已獲得改善。相較於四頻，雙頻螢光定序原本就是為了提升訊號的鑑別度，讓叢集能在相近的運作時間內被建構得更大而設計，如今再搭配改良後的試劑，螢光訊號強度進一步提升，定序的品質也變得更有保障。
Illumina與Life兩家次世代定序大廠在專利權官司裁判之後，於2017年破天荒攜手合作打造了新的定序平台-iSeq100。這是Illumina有史以來輸出量與機台體積最小的定序儀，不但首度捨棄了拍照系統，改用CMOS感光晶片來記錄螢光訊號 (見下圖二)，同時僅只用了一種螢光變化來鑑別四種核苷酸。
圖二、iSeq的CMOS flowcell與叢集序列的螢光偵測示意圖
不同奈米孔洞 (Nano well)中一一生長的DNA叢集，當螢光試劑透過流體通道 (Flow channel) 與DNA序列的核苷酸結合後，定序系統就會從正上方打入單色激光 (Single color excitation light)，激發出核苷酸上結合試劑的相對應螢光，而位於底部的CMOS感光晶片 (CMOS photodiodes)則負責進行螢光訊號的讀取。(圖片來源：Illumina, Inc. (2018). llumina CMOS Chip and One-Channel SBS Chemistry.)
1-Channel Chemistry (單頻螢光化學)的定序邏輯參考圖一(右)所示。單頻螢光定序有兩階段感光偵測步驟，核苷酸僅有T與A帶有相同的一種螢光，但是A的螢光額外增設了可在第一次偵測後即被第二劑試劑切除的設計。而C則攜帶了一個鏈結分子團 (linker group)，可於第一次偵測後藉由第二劑試劑補進一個螢光；G則依舊完全不帶螢光。在單頻螢光定序系統的這兩個感光偵測階段中，第一階段會發光者為A或T，經過第二劑試劑處理後於第二階段仍能發光者為T，不能再發光者為A；第一階段不發光者為C或G，經第二劑試劑處理後在第二階段能發光的為C，仍舊不發光者為G (詳見下圖三)。這套新的定序系統因為不需拍照故偵測更迅速，因為不需將圖像轉成訊息，所以程式處理也更為快捷。至於容易被人質疑的定序品質，於後期定序平台導入patterned flowcell技術後，叢集被錯認的機率已明顯降低。
圖三、單頻螢光定序的核苷酸轉換螢光變換邏輯
圖片來源：Illumina, Inc. (2018). llumina CMOS Chip and One-Channel SBS Chemistry
以上三類型螢光頻率定序平台所取得的結果資料，其品質經過相同樣品的定序資料比對後，確定盡皆穩定且均具高度相似性，甚至其定序資料與IIlumina的其他平台也都能拿來互相比對；推究原因，主要是上述三類型定序平台所有邏輯的核心技術皆建立在Reversible terminator–based SBS技術基礎上之故。那麼，Illumina未來是否能帶來更多的嶄新創意，將定序技術不斷向上提升，我們就繼續拭目以待吧！
參考文獻
1. Illumina, Inc. (2018). History of Sequencing by Synthesis: The evolution of the next-generation sequencing technology powering Illumina instruments. Retrieved from https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/illumina-sequencing-history.html
2. Illumina, Inc. (2016 Oct 5). Illumina Sequencing by Synthesis. [Video file]. Retrieved from https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8&t=41s
3.Illumina, Inc. (2016). Illumina Two-Channel SBS Sequencing Technology: High data accuracy with faster data generation. Retrieved from http://www.well.ox.ac.uk/ogc/wp-content/uploads/2017/09/techspotlight_two-channel_sbs.pdf
4.Illumina, Inc. (2017 Nov 17). Library pooling guidelines for the NextSeq and MiniSeq systems. Retrieved from https://support.illumina.com/bulletins/2016/10/library-pooling-guidelines-for-the-nextseq-and-miniseq-systems.html
5.Illumina, Inc. (2018). llumina CMOS Chip and One-Channel SBS Chemistry. Retrieved from https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/techspotlights/cmos-tech-note-770-2013-054.pdf
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