Library construction過程中,DNA及RNA濃度的精準測定是相當重要的。尤其在製備library之前,必須要了解樣品的濃度,才能取出適當總量的DNA或RNA做為製備的原料,若因為濃度偵測的不準確,會導致最後library產物總量不足夠上機定序。目前常見的DNA及RNA濃度測定方法有吸光值測定法、專一性螢光染劑測定法。

 

一.  吸光值測定法

Beer-Lambert law顯示,分子對於特定波長光之吸光程度會隨著分子濃度而有所不同,所以可以藉由測量溶液的吸光程度optical density推估分子的濃度1DNARNA分子會吸收波長260nm的光,所以可藉由260nm的吸光值換算成濃度(如下圖所示)。此測定法操作簡單且快速,但極容易造成量測的不準確,因為若萃取DNARNA的過程中,溶液混有其他也會吸收260nm波長光的物質,常常會造成高估DNARNA的濃度,進而影響後續實驗的進行。

圖片1.png  

二.  專一性螢光染劑測定法

 

特定的螢光染劑2僅會與DNA或RNA專一性結合,所以利用此染劑與樣品混合後,再偵測樣品中的螢光強度,便能得到DNA或RNA的濃度。在測量過程中,此方法能降低溶液中其他化學物質的干擾,提供較吸光值測定法更精準的濃度讀值。除此之外,專一性螢光染劑測定法能分別測得溶液中的DNA及RNA濃度,此資訊是吸光值測定法無法提供的,此特性可進一步提供實驗人員了解RNA樣品中是否有DNA的汙染,反之亦然。

下表列出上述兩個濃度測定法之特性比較,雖然專一性螢光染劑測定法在操作上較為繁雜,但經實驗證實3專一性螢光染劑測定法準確度較吸光值測定法精準。

 

目前有勁對於樣品的濃度測定是兩種方法都會做,但以專一性螢光染劑測定法做為樣品收件與否的指標,以最嚴謹的方式完成library的製備。

圖片2.png  

Reference
1.    Sambrook and Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2.    www.invitrogen.com/qubit
3.    http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/cell_tissue_analysis/Qubit-all-file-types.Par.19803.File.dat/CO16190%20Qubit%20Brochure.pdf

logo_121_55.png  

YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()