在原核生物中,mRNA 只佔全部 RNA 的 1-5%,其餘絕大部分是 ribosomal RNA,因此若要定序 mRNA 首先必須先將 mRNA 純化出來,然而,原核生物並不像真核生物 mRNA 具有 poly A 的結構,因此,無法直接利用 oligo T 將 mRNA 純化出來,如果拿 total RNA 進行定序,那麼定序的效率一定會非常差,因為大部分的序列都來自 rRNA;如何提升原核生物 mRNA 的量,已成為 NGS 系統的重要議題,目前,提升原核生物 mRNA 的量,最主要的方式不外乎分為兩大類,第一類是減少 rRNA 的量(下圖 a 與 b ),圖 a 的方式是利用 rRNA 的 probe 將 rRNA 去除,這也是最常用的方式,然而,去除 rRNA 的效率會與 probe 序列的設計與生物物種有關;圖 b 的方式是利用針對 rRNA 作用的酵素將 rRNA 去除,主要是利用原核生物的 mRNA 5’端有三個磷酸,而此酵素無法對三個磷酸的結構作用,因此,能夠有效去除 rRNA。

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另外一大類則是將 mRNA 分離純化出來(上圖 c 與 d ),圖 c 的方式是利用 E. coli 的 poly A polymerase 將 mRNA 3’端接上 poly A,再利用 oligo T 將 mRNA 純化出來;圖 d 的方式是利用 Co-IP 的方式針對 RNA binding protein 進行 IP,最後再將 mRNA 純化出來。

以上四種方式是目前比較常見的方式,各有其優缺點,主要還是依不同研究的需求,找出最適當的方式。

 

reference: http://www.nature.com/nrg/journal/v11/n1/full/nrg2695.html

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