在Re-sequencing 的分析中，將Paired-end reads 對回到參考序列後的SAM 格式中，其中一個欄位”FLAG”,將會記錄paired-end reads 對回參考序列的特性。FLAG定義reads對回參考序列後的幾種特性，如圖一所式，其計算方法則是將read含有的每一個特性所對應的數值相加。
圖一:SAM format中的FLAG欄位
藉由以上的定義，如果一對paired-end reads 在合理的inserted-size下map到同一條參考序列，稱為Concordant pairs，會有圖二及圖三的兩種情形。
圖二: Concordant pairs 對回參考序列的情形，其READ1為forward mapping，FLAG為99；READ2為reverse mapping，FLAG為147。
圖三: Concordant pairs 對回參考序列的情形，其READ1為reverse mapping，FLAG為83；READ2為forward mapping，FLAG為163。
若一對paired-end reads的READ1及READ2分別map到不同的參考序列，稱為Discordant pairs，有圖四及圖五的兩種情形。在分析的應用上，如是genomic DNA，有可能是genome rearrangements後造成，或病毒序列鑲嵌到宿主DNA後造成的情形。如是RNA-Seq，則有可能fusion gene或trans-splicing造成的。
圖四: Discordant pairs 對回參考序列的情形，其READ1為forward mapping，FLAG為97；READ2為reverse mapping，FLAG為145。
圖五: Discordant pairs 對回參考序列的情形，其READ1為reverse mapping，FLAG為81；READ2為forward mapping，FLAG為161。
若一對paired-end reads的READ1及READ2只有其中一邊有map到參考序列，另一邊的READ沒辦法對到參考序列，則有圖六~圖九的情形，unmapped read依造定序的種類有不同的可能，如是genomic DNA，unmapped read有可能是橫跨genome rearrangements中的break point，或是病毒序列鑲嵌到宿主DNA後的Insertion size。如是RNA-Seq，則有可能是novel gene中的exon boundary或fusion gene或trans-splicing中的fusion transcript的break point。
圖六: READ1為forward mapping，其FLAG為73；READ2為unmapped，FLAG為133。
圖七: READ1為reverse mapping，其FLAG為89；READ2為unmapped，FLAG為133。
圖八:READ1為unmapped，FLAG為69；READ2為forward mapping，FLAG為137。
圖九: READ1為unmapped，FLAG為69；READ2為reverse mapping，FLAG為153。
這邊我們舉了Illumina platform定序後的paired-end reads常碰到的flag組合，在不同sequencing platform或alignment parameters下會有很多可能性，可供後續生物資訊分析來擷取資訊。
補充：在 2013年5月22日，本部落格發表一篇對於FLAG換算的文章，請參考"SAM format中的FLAG應用 - FLAG換算"
留言列表
{{ article.title }}
