自從 NGS 技術發展至今,已有無數的古老生物被進行定序,這些生物樣品可能來自數千年以前。為了進行定序,首先需要將這些受損或降解的 DNA 片段製備成可供 NGS 定序儀上機使用的 library,而製備的目的主要是讓 DNA 片段兩端接上人工合成的 adapter,一則可起始定序反應,一則可用作 PCR 增輻反應。目前製備的主流方式分為兩種:一種是 454 Life science 使用的 blund end ligation;另一種是 Illumina 使用 Y 型結構的 adapter 進行 A-T ligating,不論何種方式,均為雙股 DNA 的黏合反應,然而,在操作古老 DNA 時,這種製備流程可能會發生一些缺憾。

 

使用新的單股 DNA 來製備 NGS library,比較目前常見的方式具有以下的優點:

第一、製備過程中 DNA 標示上 biotin,因此純化的步驟使用 streptavidin-coated的磁珠,能減少樣品流失。

第二、當 DNA 品質很差,在環境壓力或溫度破壞下出現單股 DNA 的形式時,只有使用單股 DNA 的製備流程能夠保留它並且成功製備成 library

第三、雖然原理不相同,但使用單股 DNA 的製備流程仍然具有避免產生 adapter dimer 的機制以避免影響定序品質。

 

單股 DNA 進行 NGS library 的製備過程簡述如下 (圖一)

1. 使用 phosphatase 去除磷酸根避免樣品 self ligation,及移除 deoxyluracil

2. 加熱使 DNA 變成單股,隨後黏上一段單股 3’端帶有 biotin adapter

3. 使用 streptavidin beads 固定 biotin-DNA,加入一段 5’tailed primer    adapter 雜合。

4. 使用 DNA polymerase I 補齊互補股,再使用雙股的 adapter 進行游離端的blund end ligation

5. 上一步驟的 adapter 經過設計只有單股可以黏上 DNA fragment,因此在進行下一步驟的熱處理時,只有 DNA polymerase I 複製出的互補股會包含兩端 adapter

6. 進行互補股的 PCR 增幅,同時利用 primer 將增輻片段加上 index 序列。

 

    藉由上述單股 DNA 製備 NGS library的流程,即使 DNA 受到損壞變成單股,也能在製備 library 的過程中被保留並且上機定序,因此可望能在研究古生物 DNA 的基因體中獲得更完整序列。然而,考量到成本以及操作時間,因此,一般的 DNA library 還是適合使用官方雙股 DNA 的製備流程,在何種情況下使用不同的製備流程,就要由研究者來決定了。

圖一、

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參考文獻:

Gansauge, M.-T., Meyer, M. Single-stranded DNA library preparation for the sequencing of ancient or damaged DNA. Nature protoc. Vol. 8 NO.4 737-748 (2013). 

 

 

 

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