在先前的部落格中我們介紹過了在Windows 7平台下利用bowtie或bowtie2將NGS定序的資料和reference序列作alignment,並利用samtools進行檔案的處理以及利用IGV觀看瀏覽alignment結果

詳細內容可參照:

1. bowtie教學

2. bowtie2, samtools教學

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自2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System後,開啟了次世代定序的大門,經過不到10年的時間,第三世代的定序技術平台也問世了。本篇文章主要是介紹2010由Pacific Biosciences 公司發表的定序平台---PacBio RS,以及其定序原理---Single Molecule Real Time (SMRT) technology。

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Figure 1. Zero-mode wave-guides (ZMWs) – small well-like containers & SMRT Cell & PacBio RS (擷取自http://smrt.me d.cornell.edu/FAQs.html)

 

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癌症是個一直不斷在發展、演進、隨著環境改變的多樣化疾病。隨著對癌症的了解越多,癌症的異質性現象已經是許多關於轉移、抗藥性等的研究課題。1976年時Peter Nowell 曾發表他具有遠見的想法,癌症是變異細胞的演化過程,並且不斷的進行著環境篩選,造就了癌症細胞具有多樣的基因變化。也因此,個人化治療成了現在癌症治療的努力目標。關於癌症的異質性,如下圖一,除了類似癌症不同病人間會有異質性,同一個病人本身的癌組織也會有異質性。同一病人的癌組織的不同區域會有異質性,而原位癌組織與後續的附近區域、或是轉移、復發的癌組織也會彼此之間有異質性。

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 圖一 癌組織異質性之示意圖

當前的診斷與治療模式

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近年來,生物技術發展多樣性,以及許多高分子材料(如:奈米粒子)的研究精進,其中更以『磁分離(Magnetic separation)』概念的純化機制,結合分生、物理與化學三者合一,具實驗獨特性。此技術涵蓋範圍廣泛,在核酸領域的應用方面,舉凡:poly-A mRNA的分離、DNA的純化與次代NGS定序,都有此技術參與其中,除此之外,也可應用於蛋白質純化,免疫學等用途。分生實驗過程的核酸分離和純化,會因目的性不同,而於帶磁性奈米粒子的表面,鑲嵌不一樣的配體(ligand),以利進行結合與親和的反應,常見例如:結合poly-A mRNAoligo-(dT)streptavidin等鑲嵌配體。這類型的實驗分離方式,泛稱為SPRISolid Phase Reversible Immobilisation)是一種固相-液相可逆化固定的分離純化技術,比起矽粒子(主要成分為SiO2)的分離更有效率,此項發明影響生命科學實驗的發展,有著舉足輕重的地位,亦逐漸成為現今NGS製備Library方面,於DNA的純化分離與分子量大小之篩選(size selection),不可或缺的一項工具,也是實驗步驟不可缺少的環節。

磁珠的發明構想與概念,最初由任教於挪威科技大學的化學家John Ugelstad 所研發製成,他在聚合物和膠體化學的領域貢獻甚多,也於1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)為主要材質,製造出均勻磁化的球體粒子稱為Dynabeads® ,這也是影響日後生物實驗材料革命性的重大突破。

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RNA 樣品製備 NGS 定序上機的前端作業方面,Illumina 所採用的方式是使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 PolyA tailmRNA,然而這種方式面對品質較差的 RNA 時,將會受到限制,並且一些不帶有 PolyA tailmRNA,將無法被觀察到,因此有其他廠商使用其它的策略發展新的製備方式,如:NuGEN Ovation,它可以使用少至 500 pgRNA 來完成 library,並且即使 RNA 品質較差,依然可以適用。

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圖一、 NuGEN 開發Ribo-SPIA 技術轉成雙股 cDNA

 

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 ISEGB2013

隨著次世代高通量定序技術(Next Generation Sequencing, NGS)的蓬勃發展,近十年來該技術已成為研究生物基因體演化的基礎工具。雖然台灣近幾年已陸續有相當多的研究人員投入相關技術的發展,然而因應NGS技術所產出的基因體資料,需要更多的領域研究動能投入分子演化與生物資訊之研究平台。因此,透過國際及國內研究社群,建立此互動平台,方能提升研究水準,增廣視野並提攜後進,以永續研究動能。

 2012年ISEGB國際研討會成功地在台灣南部的國立中山大學舉辦!近250位人士參與盛會!與會者涵蓋演化與計算生物學等各領域的專家學者、年輕研究學者、教授、博士後學者及研究生。首次舉辦的NGS研習會是國內首先完整地從基因體學的上游實驗準備到下游資料分析、結果、闡釋等實務流程的經驗分享,並教授基因體學與轉錄體學之方法,研習會的成效及口碑良好,今年照常舉行。

 

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合照

澎湖後灣沙灘跳跳樂 

 

【第一天】

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Long Non-Coding RNAs為一種不會轉譯成protein的transcripts,長度通常大於200bp,最長可超過10000bp,部分的lncRNA跟mRNA一樣會有alternative splicing,因為和基因的結構相似但不會轉譯成蛋白,早期稱為假基因(pseudogene) ,然而越來越多的研究顯示lncRNA本身參與許多生物調控,如下圖

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a.     lncRNA HOTAIR,Xist,RepA,Kcnqot1會促使Polycomb complex調控X染色體進行Chromatin remodeling (X異染色質生成,抑制其上面的基因表現)。
b.     以基因cyclin D1基因為例,會受到lncRNA的調控抑制基因表現 (cyclin D1基因表現下降)。

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火星一直被許多人討論可能會在數十億年前有生命體的存在,甚至上火星的探勘器有發現疑似是水的流路或冰河痕跡,所以更有科學家大膽推測地球上的生命是源自火星。當然這些討論及假設目前並沒有確切證據可以證實,但回歸到地球生命的本質,DNA及RNA架構了生命體,所以找尋火星上是否有DNA或RNA的存在,並且進一步定序,可提供科學家許多的資訊來找尋生命的蹤跡及推斷生命的起源。若直接由火星採集樣品再回地球執行定序,在時間上會非常耗時(來回火星及地球就要耗費數年),除此之外,DNA及RNA也有可能在運送過程中降解,所以研究人員希望能夠直接在火星上執行定序,稱之為in situ Life Detection,如此可立刻知道定序的結果,若有問題亦能立即再採樣。

        麻省理工學院Christopher E. Carr研究團隊提出使用次世代定序系統執行in situ Life Detection任務的概念,並且認為相對較為單純的無光學系統半導體定序技術是較為適合的平台,然而在外太空輻射線充斥的環境下,可能會對於定序過程有所影響,因此,他們將Ion torrent的314 chip處理各式各樣強度及種類不一的輻射(Fe-56, O-18, H-1),並進一步分析其產生的影響,實驗設計如下表所示,總共40片的chip,其中20片用電子的方式測試輻射照射前及後的影響,另外20片經輻射照射後,直接拿來定序E. coli的DNA,並且分析定序結果。

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在現今科技進步的社會中,NGS除了扮演尋找SNP與mutation或是de novo sequencing…等等也讓科學家縮短了研究各式各樣基因圖譜的時間。但很遺憾的是目前NGS的前置作業也就是製備library的方法,並沒有可以完完全全代替人力的自動化系統來完成library,因此為了彌補這項缺失Hanyoup Kim,et al.等人開發針對illumina定序平台的自動化library製備系統,此系統稱為microfluidic system,這套系統結合了droplet-based digital microfluidic (DMF),所以library製備可以在此系統完成。(如下圖)

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a. 指microfluidic system,而右上角長條狀的圖示則表是DMF-capillary interface。

b. 左邊圖示原理圖,右邊則是利用microfluidic方法製備DNA library的說明圖。

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Biocomicals (網址:http://www.biocomicals.com/comics/,生物相關漫畫部落格)

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此網站由一群具有科學和醫藥背景的網路漫畫家所組成,透過開放式的創作平台,將各種有趣的構想圖像化,平均一周有3~4篇的漫畫產出。更多有趣漫畫請連結至該網站觀看

  

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