火星一直被許多人討論可能會在數十億年前有生命體的存在,甚至上火星的探勘器有發現疑似是水的流路或冰河痕跡,所以更有科學家大膽推測地球上的生命是源自火星。當然這些討論及假設目前並沒有確切證據可以證實,但回歸到地球生命的本質,DNA及RNA架構了生命體,所以找尋火星上是否有DNA或RNA的存在,並且進一步定序,可提供科學家許多的資訊來找尋生命的蹤跡及推斷生命的起源。若直接由火星採集樣品再回地球執行定序,在時間上會非常耗時(來回火星及地球就要耗費數年),除此之外,DNA及RNA也有可能在運送過程中降解,所以研究人員希望能夠直接在火星上執行定序,稱之為in situ Life Detection,如此可立刻知道定序的結果,若有問題亦能立即再採樣。

        麻省理工學院Christopher E. Carr研究團隊提出使用次世代定序系統執行in situ Life Detection任務的概念,並且認為相對較為單純的無光學系統半導體定序技術是較為適合的平台,然而在外太空輻射線充斥的環境下,可能會對於定序過程有所影響,因此,他們將Ion torrent的314 chip處理各式各樣強度及種類不一的輻射(Fe-56, O-18, H-1),並進一步分析其產生的影響,實驗設計如下表所示,總共40片的chip,其中20片用電子的方式測試輻射照射前及後的影響,另外20片經輻射照射後,直接拿來定序E. coli的DNA,並且分析定序結果。

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在現今科技進步的社會中,NGS除了扮演尋找SNP與mutation或是de novo sequencing…等等也讓科學家縮短了研究各式各樣基因圖譜的時間。但很遺憾的是目前NGS的前置作業也就是製備library的方法,並沒有可以完完全全代替人力的自動化系統來完成library,因此為了彌補這項缺失Hanyoup Kim,et al.等人開發針對illumina定序平台的自動化library製備系統,此系統稱為microfluidic system,這套系統結合了droplet-based digital microfluidic (DMF),所以library製備可以在此系統完成。(如下圖)

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a. 指microfluidic system,而右上角長條狀的圖示則表是DMF-capillary interface。

b. 左邊圖示原理圖,右邊則是利用microfluidic方法製備DNA library的說明圖。

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Biocomicals (網址:http://www.biocomicals.com/comics/,生物相關漫畫部落格)

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此網站由一群具有科學和醫藥背景的網路漫畫家所組成,透過開放式的創作平台,將各種有趣的構想圖像化,平均一周有3~4篇的漫畫產出。更多有趣漫畫請連結至該網站觀看

  

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上圖來源於(http://sourceforge.net/projects/trinityrnaseq/files/misc/RNASEQ_WORKSHOP/rnaseq_workshop_slides.pdf/download)

此套分析流程的開發團隊將此protocol取名為燕尾服(Tuxedo Suite),目的是將NGS技術定序RNA-Seq的reads透過alignment到已知基因體序列後,進行重組轉錄本(transcript reconstruction)、genes/transcripts 定量及分析不同condition間有顯著差異的genes/ transcripts,最後在搭配R語言將統計結果圖像化;此套分析流程適用於有已知基因體序列的物種(例如:人類、老鼠、斑馬魚、阿拉伯芥、番茄..等)。

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現代醫學中,基因檢查已經占據越來越重要的地位。早期臨床基因定序主要把焦點集中在與疾病有單一因果關係的基因檢查。例如如果病人有疑似囊狀纖維化(cystic fibrosis)的病徵,會選擇檢查CFTR 基因來確認疾病病因。而使用的方法主要為sanger 定序法。

 Sanger 定序法在過去30年一直是臨床基因定序的標準檢驗法,此方法基本定序原理並沒有太大改變,但也不斷在自動化與偵測上有長足的進步。然而近年來,次世代定序(NGS)的發展大幅增加了定序的能力,降低單一鹼基定序所需的成本,也讓當前的基因定序檢查不再是受限於基因的大小或多寡。

 多基因檢查:

主要應用多為遺傳疾病的確診。近年來癌症治療也多有藉由多基因檢查來預測效果。由於次世代定序的發展,基因數目已從過去的單一基因到現在大量基因檢查。下表羅列了國際上現有的一些多基因次世代定序組合。

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在有勁生技優秀同仁的努力下,本公司部落格"有勁的生物與資訊"已經成立800天,部落格人氣超過八萬人次,文章總數已達到125篇,透過部落格讓許多學術單位和產業界更加認識有勁生技的專業。
BLOG_Top79  
 
在此告訴大家一個好消息,有勁部落格排行名列痞客邦醫療保健類前一百名,前一百名中是唯一一個定序技術的部落格,透過充實的文章內容,讓我們與其他有醫師/藥師駐站的人氣部落格不分軒輊。再次謝謝各位同仁不吝於分享你的專業,用你/妳的專業充實有勁的部落格。

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A型流感病毒是人類最常感染的流行病毒 。以2009年發生大流行的H1N1為例,H1N1屬於A 型流感病毒,其病毒的基因是由人、鳥禽和豬的基因所組成。患有H1N1 的患者可能會有發燒、頭痛、全身性肌肉痠痛、咳嗽、喉嚨痛和鼻塞的症狀。而這種高度傳染的病毒有曾被世界衛生組織發出等級6的流行病警告。

由於病毒的高度抗原漂變(Antigenic drift )的能力,讓流感疫苗的效果有限。除此之外,病患若是同時感染兩種病毒,而使的不同病毒之間發生基因的片段重組(antigenic shift),使的在2009年發現了新型的病毒變種,而造成流感大流行。

Oseltamivir (奧司他偉,俗稱克流感)是其中一種針對H1N1的神經氨酸酶(Neurminidase, 簡稱NA,主要功能是幫助新生成的病毒脫離被感染的宿主細胞)有效抑制活性的藥物。而A 型流感病毒具有Antigenic drift和antigenic shift的特性,在神經氨酸酶基因發生突變,所以在2007-2008年,雖然只發現少數的對克流感有抗藥性的 H1N1 病例,但而後發現之後的H1N1亞型流感有99.4% 幾乎都有抗藥性。

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SSR(simple sequence repeat)是指兩個或多個核甘酸重複排列,重複的核甘酸稱為一個motif,重複的次數在不同的個體或族群中會有所不同,為一種多型性(polymorphism)的類型;以Jun在大豆芽的研究為例,如下圖一,研究團隊收集了不同區域的大豆芽(soybean aphid),分別在美國的俄亥俄州(OH)、伊利諾州(IL)、明尼蘇達州(MN)及加拿大的安大略省(ON),可發現不同區域的大豆芽,motif重複的次數會有所相異。

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在Jun的研究中,為第一個針對大豆芽的genomic DNA使用NGS定序後,經過de novo assembly後的contigs從中找尋SSR marker及比較在不同區域中的genetic diversity。同樣的分析概念也可應用於RNA-Seq,在Parchman的研究中,定序了黑松(P. contorta)的RNA,透過de novo assembly及reference-guided assembly後的contigs,來找尋SSR marker,圖二為Parchman研究中的流程,可供想做相關研究的團隊一個參考。

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在今年五月的部落格” 基因體註解(genome annotation)面面觀 ─ 淺談KEGG資料庫”中,介紹到基因註解的粗略概念和簡介KEGG資料庫。在本篇部落格,我們將繼續介紹如何使用KEGG資料庫以及其他蛋白質交互作用資料庫。

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上圖為該網站的首頁(http://www.kegg.jp/kegg/)

當我們拿到龐大的次世代定序資料,這些資訊經過序列組裝(De novo assembly)和基因預測後,可以得知某特定物種的基因序列,然而,這些序列需要經過註解才能推測其生物功能。在此篇部落格我們將介紹利用KEGG的網站服務BLAST來註解有興趣的基因序列。

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    不久前炒得沸沸揚揚的社會新聞,「麥當勞驅趕唐氏症者」這個斗大的新聞標題,不僅震懾社會大眾,而且引發國內民眾高度的關注,由此事件讓大家重新審視唐氏症於社會上的待遇與生活情況。唐氏症(Down syndrome)這個名詞其實大家應該不陌生,最初由John Langdon Down 醫生,於1866 年首次發表此相關外表徵狀;接著在1959 年,由Jerome Lejeune 等遺傳學者發現該症狀是由於染色體缺陷所造成。所謂的唐氏症,簡言之,就是精或卵於減數分裂時所產生的非單套異常,使原本兩兩配對的23 對染色體(包含性染色體XX XY),其中第21 對染色體有三條染色體的不成雙配對現象(即trisomy 21),造成細胞有46+1 條之染色體異常病變,這種患者會伴隨智能障礙等現象,唐寶寶的照料其實會對家屬造成終其一生的心理與經濟之負擔。因此,如何在懷孕初期預防此種染色體異常的胎兒出生,無論是對家庭或是社會,無一是正面的消息。

    其實生殖醫學的進步皆有脈絡可循,追溯歷史沿革的演進過程,自1947 年首次在血液中發現游離核酸Cell-free DNAcfDNA)之存在以來,直至1997 年,此項發現才開始漸趨應用在醫學方面,並且首次研究懷孕母親血漿內含有胎兒之游離核酸(cell-free fetal DNAcffDNA),這項劃時代的發現,在胎兒醫學上儼然成為矚目的未來之星。近幾年,隨著次代定序(Next generation sequencingNGS)的技術發展不斷突飛猛進,更加速cffDNA 的研究進展與醫學應用性。直接影響所及,即為可利用無創性且低風險的方式(如:抽血等)獲取懷孕母親的cffDNA,進而利用NGS 定序搭配生物資訊的分析,初步比對胎兒在第21 對染色體上,其是否有造成唐氏症之不成對疑慮(圖一),藉此也可大幅降低羊膜穿刺的醫療行為所造成較高風險之產檢。除此之外,Swanson 等學者整理不同實驗室之研究數據,這些報導皆針對35 40 歲高齡產婦的對象,於其懷孕3 4 個月期間抽取cffDNA,利用NGS 技術進行定序,進行關於染色體所造成遺傳疾病之相關研究,比較四個不同研究團隊的實驗結果均顯示對偵測染色體數目異常之敏感度(sensitivity)與專一性(specificity)皆有相似之處,意味著利用 NGS 進行非侵入性的產前檢查,也具有相當程度的可靠性。利用此項NGS 技術,除可觀察到 trisomy 21 導致的唐氏症外,其他在醫學同屬常見之遺傳症狀染色體不成對(Aneuploidy),如:trisomy 18 導致艾德華氏症(Edwards syndrome)、trisomy 13 導致巴陶氏症(Patau syndrome)及透納氏症(monosomy X)等,也可透過次代定序的技術,檢測出這些可能造成胎兒不正常的遺傳疾病(表一)這項新一代之定序技術發展及推廣,不僅將會是未來產檢的趨勢,且於國內外皆已廣泛宣傳推行,並逐步被民眾接受與採納。

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    隨著 NGS 技術演進,這項越來越成熟的技術慢慢促進許多領域的發展及快速成長,包括人類發展學、基因表現及調控、基因變異學及年齡與衰老相關研究等,未來更有可能影響醫藥、健康看護、疾病預防及臨床醫藥治療等領域發展。

    樣品製備成 library 提供 NGS 上機在這項技術占有很重要的地位,目前在操作 whole genomic DNA library 時,首先需要面對的問題是如何將 genomic DNA 片段化至適當的大小,並且必須盡可能使斷點隨機及減小 DNA 受損程度。目前常見的方式是使用物理性的超音波震碎,例如:CovarisBiorupter,或是使用液態壓力將分子截斷,例如:Hydroshear,除此之外,尚有使用特殊酵素 (fragmentase) 切斷 DNA 的方式及 transposon 插斷 DNA 的方式。

   微波爐加熱應用在實驗室工作上並不少見,它被使用在促進細胞裂解、加速化學反應,微波爐的放射線被應用在增加酵素裂解蛋白質反應速度,然而應用在處理核酸裂解方面目前則從未被實驗過,若能控制得並再現性高,想必可以同時擁有減少實驗時間及同時處理大量樣品兩項優點。

   微波爐的DNA 的片段化實驗以以下方式來進行,調整不同溫度及時間測試 genomic DNA 的變化,而常見的 Covaris 超音波震碎法以及較少見的高溫處理法被用來當作此項實驗的對照組,處理後以洋菜膠體電泳方式確認 DNA 分子大小分布。隨後,依照 Roche 454 library 製備標準流程建構 library,在 ligation 後的產物,使用 Bio-Rad real-time PCR 試劑分析並且同時放大總量,純化後再以 Agilent 2100 bioanalyzer 自動電泳觀察 library 分子量大小,最後以 Roche 454 pyrosequencing 系統上機定序及後續軟體分析數據。

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