近年來,生物技術發展多樣性,以及許多高分子材料(如:奈米粒子)的研究精進,其中更以『磁分離(Magnetic separation)』概念的純化機制,結合分生、物理與化學三者合一,具實驗獨特性。此技術涵蓋範圍廣泛,在核酸領域的應用方面,舉凡:poly-A mRNA的分離、DNA的純化與次代NGS定序,都有此技術參與其中,除此之外,也可應用於蛋白質純化,免疫學等用途。分生實驗過程的核酸分離和純化,會因目的性不同,而於帶磁性奈米粒子的表面,鑲嵌不一樣的配體(ligand),以利進行結合與親和的反應,常見例如:結合poly-A mRNAoligo-(dT)streptavidin等鑲嵌配體。這類型的實驗分離方式,泛稱為SPRISolid Phase Reversible Immobilisation)是一種固相-液相可逆化固定的分離純化技術,比起矽粒子(主要成分為SiO2)的分離更有效率,此項發明影響生命科學實驗的發展,有著舉足輕重的地位,亦逐漸成為現今NGS製備Library方面,於DNA的純化分離與分子量大小之篩選(size selection),不可或缺的一項工具,也是實驗步驟不可缺少的環節。

磁珠的發明構想與概念,最初由任教於挪威科技大學的化學家John Ugelstad 所研發製成,他在聚合物和膠體化學的領域貢獻甚多,也於1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)為主要材質,製造出均勻磁化的球體粒子稱為Dynabeads® ,這也是影響日後生物實驗材料革命性的重大突破。

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SPRI純化主要實驗流程,是將核酸置入擁擠試劑(Crowding agent)【此試劑主要由鹽類(通常是NaCl)與聚乙二醇(Polyethylene glycolPEG),在特定濃度條件(20 PEG 2.5M NaCl)所形成之液態介質】,並且與試劑中的磁性球體進行結合,經由 80乙醇對核酸-磁珠複合物進行洗滌,並且去除擁擠試劑,最後,留下緊密結合核酸的磁珠,再藉由緩衝溶液(如:Tris-HCl buffer)或二次去離子純水(Distilled and deionized waterD.D.H2O,將附著於磁珠表面的核酸萃取回收。

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奈米等級的Dynabeads表面性質不同,其分離純化原理亦不盡相同,但基本上固態的球狀材料組成並無太大差異,基礎結構分為三層,最內層的核心是聚苯乙烯,第二層包覆著磁性物質四氧化三鐵FeO,最外層表面主要是羧基修飾的高分子carboxyl groups- COOH所構成,羧基可以與核酸進行結合。至於聚乙二醇(PEG)的功能主要是增加混合物的黏稠程度,使磁珠存在其中呈懸浮狀態而不易沉降,其空間位置的碰撞與排斥,增加核酸與磁珠的聚集效率,除此之外,聚乙二醇與蛋白質的相容性佳,亦可去除樣品中的蛋白質。

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 帶負電荷的DNA在緩衝溶液裡,不僅與PEG和鹽類離子進行交互作用,同時亦要與帶負電羧基結合,但如何解釋負電之間的不相容,此機制還尚未被完全理解。目前只能藉擁擠試劑中的鹽類(如NaCl)進行解釋,推論在特定濃度的鹽類中導致DNA發生脫水反應,產生構型改變且暴露負電之磷酸根,藉由解離的鈉離子(Na+)所形成之離子橋(Cation bridge),使DNA與羧基能進一步之鍵結,隨著擁擠試劑(PEG和鹽類)去除之後,加入緩衝溶液改變其中的pH值或離子濃度,使得吸附磁珠上的DNA被純化出來。

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最後,簡單整理一些SPRI純化的好處,利用SPRI純化核酸相較於傳統的離心方式,時效性高且形式和緩,有利保留核酸完整性,純化過程簡易,避免使用有機溶劑,如:酚(Phenol)與氯仿(Chloroform)等;其次,導入空間分子碰撞機率的概念,利用不同的磁珠比例,分離出不同分子量的核酸;第三,表面積結合能力增加(以DNA為例:1µL的磁珠最佳結合效率可以承載總量達3µg);最後,也因磁性微粒的出現,才使核酸製備實驗得以步上自動化一途。工欲善其事必先利器,選擇良好的實驗方式,才有可能得到良好品質的結果。

 

 

 

 

 

參考文獻:

 

1. Bob, Sinclair. (1998) To Bead or Not To Bead: Applications of Magnetic Bead Technology. The Scientist.

 

2. Hong-yang Yu. 2003The Mechanism Study of Plasmid DNA abstraction based on SPRI. Biological Science.

 

3. DeAngelis, M.M. Wang, D.G.and Hawkins, T.L. (1995) Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. November 25; 23(22): 4742–4743.

 

4.Stein, A. Evensen, Jacob B,. and Natvig.2013Ugelstads kuler revolusjonerte laboratoriemedisinen. Michael. 10:7–13.

 

參考網站:

 

美商貝克曼庫爾特有限公司官方網頁

https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm

 

 

 

 

 

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  • 訪客
  • 你好,
    如果將已結合DNA的磁珠,加入酒精並充分pipetting的話,之後放上磁盤,澄清液中會含有DNA嗎?還是DNA可以很完整的停留在磁珠上不溶於酒精? 謝謝
  • Hi 您好,

    謝謝您的提問。DNA在純化過程中,難免會流失。 在您的提問當中,DNA多少會殘留在澄清液當中,不過根據不同的純化套組,會有不同的純化率, 以及建議純化前的DNA總量。 建議您參考您目前所使用的純化套組, 能夠獲得更準確的純化率。謝謝。

    YourGene 於 2017/12/04 14:45 回覆

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