隨著NGS次代定序的技術不斷的推陳出新,其能力所涵蓋的層面亦越來越豐富,但一套完整的NGS,其構成的條件,不單只有最新的定序儀器就足夠,定序核酸樣品的良劣往往左右最後定序結果,所謂工欲善其事,必先利其器,要怎麼收穫就要先怎麼栽的道理。本篇文章主要淺談游離核酸(Cell-Free nucleic acids) 的品質對於NGS定序之重要性。在醫學方面,以游離核酸的研究漸趨深入,其為一種細胞外呈游離狀態的小片段核酸,存在於血液、尿液與唾液等,大部分可經由三種方式:細胞凋亡(apoptosis)、細胞壞死(necrosis)與胞泌作用(secretion)進行胞外釋放(圖一),其中又以游離DNA (Cell-Free DNAcfDNA) 應用於癌症腫瘤監控及胎兒產前的診斷(圖二)之進展最為豐富。

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圖一

 

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圖二

 

   關於產前醫學診斷方面,由於少子化的時代,相對重視每一胎的健康品質,且因應NGS時代來臨,對於產前診斷的技術又更上一層樓。此技術即利用萃取胎兒與母親交換後,飄零於血液中的胎兒DNA,進行只需抽血的低風險且無創性產前胎兒檢測,因懷孕前期,母親血液中之胎兒核酸含量不高,因此,所萃取出的核酸含量與品質的優劣,都會影響製備NGSLibrary品質。

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圖三

 

有鑑於此,於 2011年 Barrett的研究團隊,針對從孕婦血漿中分離出的cffDNAcell-free fetal DNA),進行如何最佳化保存cffDNA的相關探討,欲找出影響cffDNA比例的關鍵,進一步獲得穩定且高比例的cffDNA。因為血液樣品,從抽血至萃取cffDNA之過程中,其內會含一些去氧核糖核酸酵素等…影響物質,進而降解血液中核酸,最終可能影響獲得cffDNA的濃度與品質。Barrett等學者將血液樣品分成不同的處理方式,如:抗凝採血管之材質、保存時間、儲藏溫度,針對以上因素,探討是否對血漿中游離DNA濃度造成影響。實驗設計如下,取樣後在室溫放置不同時間(圖三A),取樣後在4℃放置不同時間(圖三B),比較同一時間點的不同溫度(圖三C),比較同一時間點的不同抗凝採血管(圖三D),觀察其中cffDNA 的含量。綜合以上實驗得知,即使保存於4℃溫度,血漿內 cffDNA含量確會隨時間降低,尤其放置24小時之後,含量從平均 10%下降2 至 3 個百分點。再者,血液樣品越新鮮越好,若樣品無隨即萃取cffDNA,則建議放置不要超過8小時,並慎選抗凝採血管的材質[其中以cell-stabilizing (S)優於K3EDTA(E) ],以利進行抽血後之血液保存。因此,唯有高品質的cffDNA,才可能有最佳化的Library品質與定序結果。

    NGS次代定序的興起,利用 NGS 喚醒漂泊於血液中的DNA,讓沉默的DNA文字,變成一句句發聲語言。不僅滿足人類探索如叢林般的未知醫學領域研究,更可能激盪出新穎檢測的可能性,為人類的醫療福祉創造無限的願景。

 

參考文獻:

1. Schwarzenbach, H., Hoon, D.S.B. and Pantel, K. (2012) Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11426-437.

2. Dennis, Y.M.L. and  Rossa, W.K.C. (2007)Prenatal diagnosis: progress through plasma nucleic acids. Nature Reviews Genetics. 871-77.

3.Barrett, A.N., Zimmermann, B.G., Wang, D., Holloway, A., and Chitty, L.S. (2011) Implementing prenatal diagnosis based on cell-free fetal DNA: accurate identification of factors affecting fetal DNA yield. PLoS ONE 6(10): e25202.

 

 

 

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