相較於傳統的microarray方法,RNA sequencing究竟有著什麼樣的優點,讓我們必須讓我們從microarray轉換到RNA sequencing呢?


RNA seq 不需預先知道genome sequence,但Microarray 需預先知道genome sequence才能進行。因此,即便是尚未完全解序完成的物種,RNA seq仍能偵測其RNA的表現量。

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(一)Illumina (Genome Analyzer)Sanger sequencing在定序前製作library過程中,是有極大差異的,最明顯的差異莫過於否需經過細菌進行質體複製。

前者(Illumina System就是指NGS)在製作library完全不需經過細菌進行質體複製就能直接進行定序,以減少錯誤發生率(如圖一)

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而後者Sanger sequencing則是在製作過程中一定需經過細菌進行質體複製才能進行定序(如圖二)

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NGS是目前最新且高通量的定序方法,所謂的NGS是指傳統定序法的改良版,而傳統定序法可以分成兩種來說明之。

 

第一種:Chemical Sequencing

 

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Metagenomics這十年來才發展出來的新學門,主要是透過研究分析環境基因體,進而來描繪環境的代謝特性。

一個完整的環境系統,是由許多種生物組成,這些生物種類包羅萬象,除了肉眼可見的動植物外,還有肉眼看不見的微生物族群,這個族群數量遠比動植物多,包含真核微生物(Eukaryotic microbes)、細菌(Bacteria)、古生菌(Archaea)以及病毒(Virus),然而,百分之99以上的微生物是無法培養的,欲描繪一個真實環境的生化代謝圖譜,最有效的方式就是直接萃取環境中的DNA或RNA加以分析,藉由這些基因體資訊,來對環境有一個全盤性的了解。環境基因體具有高多樣性以及高複雜度,最有名的例子是,Craig Venter從一桶海水中萃取細菌DNA,經過基因體分析後,發現含有150,000,000bp非重複性的鹼基對、1,800個genotype以及1,200,000個過去沒有被記錄過的基因,因此,要描繪出真實的完整的環境基因體特性,需要大量的資料量 (Venter et al., 2004)。為了研究高度複雜的環境基因體,近期發展出兩個學門Metagenomics與Metatranscriptomics;Metagenomics是在DNA的層級,來分析環境基因體;而Metatranscriptomics是以RNA的層級來分析,可以補強Metagenomics不足的部分,除了可以分析各種基因的表現量,還能夠偵測環境中的RNA病毒族群。

早期Metagenomics與Metatranscriptomics實驗流程中,必須將環境的基因體DNA或cDNA轉植到E. coli體內,再進行定序分析,其過程繁瑣而冗長,而且得到的資訊量相對有限 (Trings et al., 2005);現在metagenomics研究,可以跳過繁瑣的分子生物學實驗技術,只需要將環境中的DNA或cDNA,直接進行次代定序(next generation sequencing)。 隨著定序技術的發展,定序資料的輸出量也越來越高,也就能夠呈現基因體真實的樣貌,至2010年,一次NGS定序所能夠得到的資料量已經達到100Gb的等級,因此,面對高度複雜的環境基因體的研究,NGS是最有效率的工具。

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距今十萬年前,尼安德塔人的足跡曾遍及歐洲, 亞洲西部以及西伯利亞,而約在三萬年前,尼安德塔人族群卻忽然消失殆盡,他們為何消失? 他們與現代人是否血緣關係? 這些謎團一直是人類學家們所好奇的問題。

Svante Paabo團隊從三個尼安德塔人的骨骼中萃取DNA (圖一),利用NGS系統將其基因體進行定序,獲得超過4Gb序列資料,將其序列資料與現代人進行分析比較後發現,亞洲, 歐洲以及巴布亞新幾內亞的現代人有百分1-4%的DNA來自於尼安德塔人,而非洲裔的現代人則沒有此現象;12個非非裔(non-Africans)現代人特有的序列中,就有10個是來自尼安德塔人,這暗示著非非裔(non-Africans)的現代人祖先與尼安德塔人有雜交的現象;然而這樣的結果,與1997年Svante Paabo團隊的分析結果相左,主要是因為當時並沒有進行全基因體的比對,單單比對粒線體上的DNA,而粒線體DNA只占人類基因體的極小部分,因此,無法呈現全貌,沒有證據顯示現代人與尼安德塔人的關係;如今,定序技術的進步,使的尼安德塔人的序列得以被完整解開,進而證實非非裔的現代人皆有尼安德塔人的血統存在,這樣的結果已經改寫了人類的演化史。

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圖一 三個尼安德塔人的骨骼,是Svante Paabo團隊取樣DNA的來源。

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在進行 de novo sequencing 時,假如我們只利用NGS的資料要將全基因體序列組裝起來,通常要非常高的覆蓋率 (coverage) 才可能將基因體組裝起來,但是,如此高的覆蓋率,不但定序費用相當高,而且面對龐大的資料量,組裝所需的硬體需求將是我們所面臨的第一個難題,組裝所需的漫長運算時間,則是另一個難題,此外,組裝錯誤亦無法被查覺。

利用 Optical mapping 可以更有效率地進行 de novo sequencing ,以更低的成本,更快的速度組完全基因體序列。

首先,我們利用 Optical mapping 建立全基因體的圖譜。


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一般在做全基因體比較時,通常會先得到全基體的序列,然後再比較基因體之間的差異。

但是,當我們還不知道這些基因體是否存在差異前,貿然進行全基因體定序,倘若結果未能如我們預期,定序所花費大量的人力、物力與金錢無異是種浪費。

在定序前,我們可以先以 Optical mapping 來分析我們要比較的基因體:

  • 如果基因體間沒有差異,我們就可以節省時間與金錢,不必再做進一步的定序。
  • 如果基因體間存在差異,再進行定序的工作,如此不但工作較有效果,而且Optical mapping 的結果亦可輔助全基因定序的工作,提升全基因體定序的效率。


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菌株分型(strain typing)是分析菌株差異性常用的方法。

過去常用的方法是 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis),但是PFGE的缺點是

  1. 只提供少量的資訊
  2. 對於相近菌種的區別性不佳

使用 optical mapping 的話,即便是相近的菌株,我們仍能有效地加以區分,另外,除了分型之外,我們還能利用全基因體的比較而得知不同菌株間 insertion、deletion與基因轉置等等現象。

下圖即為 optical mapping 分析 strain typing 的結果,圖中兩菌株間的線條所標示之處即為菌株間相異之處。

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Optical mapping 是利用限制酶去裁切單分子DNA,產生單分子DNA圖譜,然後將許多單分子DNA圖譜組裝起來,以得到全基因體圖譜的一種技術。

其實驗步驟如下:

一、以PDMS組成的微流道,利用毛細現象的原理,將DNA拉直,由於微流道下方的玻片為帶有正電之玻片,利用DNA帶負電的特性,將DNA固定在特殊玻片上(正負電相吸),此時,我們會得到一條筆直的單分子DNA。

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Next Generation Sequencing 這個名稱是相較於傳統定序技術而言。

傳統的定序技術包括:

  • Chemical Sequencing
  • Sanger Sequencing

 

一般見到「傳統定序技術」大部份是指 Sanger 的定序方法。

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