• Aug 20 Sat 2011 01:29
  • N50

N50是一個用來評估de novo assembly效果好壞的方法之一。當我們把contigscaffold從大到小排列後,從最大的contig開始進行長度的累加,當累加長度達到全部contigscaffold總長度的50%時,這時所加上的contigscaffold長度,即為N50。如下圖所示:

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而N50的50,即為50%的意思。同理,N25即代表25%;N75即代表75%。數字越大,則評估條件越嚴苛。

 

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ChIP-sequencing是研究蛋白質與DNA互動的一種方法,是利用抗體與抗原結合的特性,將蛋白質與互動的DNA抓下,再透過DNA純化的方法,取得與蛋白質互動的DNA,然後透過次世代定序的技術來得到該DNA正確的序列。

 

其實驗流程為: 進行免疫沉澱,加入對目標蛋白質具高專一性與靈敏性的抗體,抓下蛋白質與其所附著的DNA,透過DNA純化去除蛋白質得到DNA,然後進行定序。

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NGS具有高輸出量的特性,而且不需經過bacterial cloning的過程,這兩種特性使得定序的成本大大得降低,至2010年底,以Illumina系統為例,定序成本,每1bp約只需要花費新台幣0.0002元,遠低於Sanger sequencing成本0.2元/bp。NGS所具有的高輸出量與高解析度特性,使其應用範圍也日趨廣泛,遍及基因體學、生物醫學、環境科學等研究 (上圖);而利用NGS 系統的研究論文也越來越多 (下圖 橘色線),數量呈現對數成長,反觀Microarray與QPCR,研究論文的數量已經趨近於飽和 (下圖 藍線與紫線),而利用Southern與Northern bolt的研究論文數量有下降的趨勢 (下圖 淡紫色線),這說明著NGS的時代已經到來,NGS技術已成熟且普及化,解決了從前的技術無法解決的難題。

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你知道嗎? 細菌族群就棲身在你的身體裡,有些住在皮膚表面,有些居住在腸內道,而不同部位的細菌族群種類也不盡相同,甚至,每個人身體上的菌相也會有所差異;2009年,美國科羅拉多大學團隊,利用NGS系統進行16S rRNA序列分析,進而描繪出全世界第一張人體菌相圖(上圖),讓我們清楚得觀察到,不同部位皆有其獨特的細菌族群,而口腔與腸道是人體菌相最複雜的地方,相較而言,皮膚表面的菌相就顯得單純;有越來越多證據顯示,人類身體的細菌族群與人體健康有關,然而,人體共生菌方面的研究仍在剛起步的階段,這群細菌的所扮演的角色還待更進一步的研究。


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融合基因 (fusion gene) 經常發現在血癌、前列腺癌及軟組織肉瘤中,並且有越來越多證據顯示與導致該癌症的發生有關係。融合基因的形成是由於染色體發生了易位 (translocation) 、刪除 (interstitial deletion) 或倒置 (inversion) 所造成,融合基因所表現的融合蛋白 (fusion protein) 在功能上會有所變異,以慢性骨隨白血病 (Chronic myelogenous leukemia) 中 BCR-ABL  融合基因為例,BCR-ABL 會表現成 tyrosine kinase 並活化細胞周期調節系統中的控制週期蛋白,加速細胞分裂,並抑制 DNA 修復,導致病變,並且在 95% 的患有慢性骨隨白血病的病人中皆有 BCR-ABL 基因,因此可當成 biomarker 來判別是否罹患慢性骨隨白血病。

 應用 NGS 的技術在 RNA-seq 上,陸續有研究在癌症發現新的融合基因,Michael F. Berger 等人在2010年使用 GA2 定序了 10 個皮膚癌樣本的 RNA-seq,從中首次發現了融合基因,對於皮膚癌在生物調控上的機制給予新的觀點及突破。

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一樣用一句話去去解釋 mate-paired 和 paired-end 的差異:mate-paired 技術可以讓定序兩端的間隔高達 2k-5k (目前新 kit 可到 10k )。如下圖所示:

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首先我們將 DNA 打斷成長度為 2000~5000bp 的片段,然後將這些片段的尾端給連接起來,因此可以形成一個環狀的 DNA。圖中的紅色和綠色圓點分別代表 DNA 的 5’和 3’端。然後再將此環形 DNA 給打斷,帶有紅色和綠色圓點的區域即為我們最後要定序的 DNA 片段。由上圖可知,mate-paired 的特色除了含有極長片段的資訊之外,也由於經過環形連接,因此其定序的方向也與 paired-end 相反,分別由原始 DNA 片段的內側往外側延伸定序,這在生物資訊的處理時是要特別注意到的地方。

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RNA-seq 是透過次世代定序的技術來偵測基因表現量的方法,在衡量基因表現量時,若是單純以 map 到的 read 數來計算基因的表現量,在統計上是一件相當不合理事,因為在隨機抽樣的情況下,序列較長的基因被抽到的機率本來就會比序列短的基因較高,如此一來,序列長的基因永遠會被認為表現量較高,而錯估基因真正的表現量,所以 Ali Mortazavi 等人在 2008 年提出以 RPKM 在估計基因的表現量。

RPKM 是將 map 到基因的 read 數除以 mapgenome 的所有 read(million 為單位)RNA 的長度(KB 為單位)

 

其公式為:

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Illumina (Genome Analyzer)與Roche (454)皆是次世代定序儀(Next Generation Sequening , NGS ),兩者的基本原理離不開sanger的鏈終止定序法(chain termintin),但是卻有不同的定序原理。

 

 

 

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RNAi 的原理漸漸被了解發現的同時,許多研究病毒的學者很快就嘗試運用這個天然的機制,來控制病毒在寄主體內的複製與發病。由於許多造成嚴重病害的病毒以 RNA 病毒為主,因此在植物病理學上,亦或是醫學上,都曾嘗試過使用 RNAi 的機制,抑制病毒的複製或是表現蛋白。在 Fire Mello 研究中提到過 RNAi 的反應會經由少量的雙股 RNA 觸發,並放大擴散整個效應,而在後續的研究中,逐漸了解這是因為雙股 RNA 被酵素RNase H剪切成為小分子的 RNA 片段,被稱為“small RNA”。這種小分子的 RNA 的反股會跟細胞內的複合物 RISCRNA-induced silencing complex)做結合,進而專一性的降解所有與這些小分子 RNA 互補的 mRNA 序列,使寄主達到如同免疫的效果。

    RNAi 應用在醫學領域治療病毒所引起的疾病,首例是用在治療 HIV 所引起的愛滋病,HIV 是一種 RNA 病毒,但是由於病毒都具有高度的突變性,因此使用專一性高的 RNAi 來抑制不斷改變的病毒核酸有些困難,但所幸 HIV 在人體感染的途徑已被研究得非常透徹,因此科學家們改變策略不嘗試抑制病毒本身的複製或是蛋白質表現,而針對病毒辨識人體細胞膜外側的 CD4CCR5 receptor 作抑制,當體細胞膜不再具有可被病毒辨識的receptor 後,病毒便無法轉移感染健康的體細胞,達到治療的功效。

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1990 年,一群植物生理科學家— Richard Jorgensen 的實驗團隊,嘗試在矮牽牛 (Petunia) 上增豔花朵顏色,而它們使用的策略是現今發展相當成熟的農桿菌轉殖基因技術以及組織培養技術。chalcone synthase (CHS),是一種開花植物形成花青素的化學路徑上,決定合成效率的關鍵酵素,當時,Jorgensen 使用高效能之 35S promoter 來大量表現矮牽牛之 CHS 酵素,他期望能產出色澤更為飽滿的美麗矮牽牛,但結果卻令他萬萬想不到。

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Jorgensen 的研究報告中顯示出,他所得到轉基因矮牽牛,不但花色沒有變深,甚至高達 42% 的矮牽牛出現白化、白斑、白色嵌紋等性狀,這個結果告訴了他一個事實,植物體內啟動了某一種未知機制,不但抑制了他所轉殖的基因表現,也抑制了自己本身該正常表現的CHS 酵素。在當時,這個現象在植物上被稱為共同抑制(co-suppression)。

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一句話去去解釋 single end 和 paired-end 的差異: single end 只讀取DNA片段的一端,而 paired-end 則是讀取兩端。如下圖所示:

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為何要有 paired-end 這樣的技術發明呢?主要的原因在於 illumina 在每一次定序的過程中,最多只能定序到 150bp 的長度。這樣的長度對比於第一代的 Sanger 定序法(約 1000bp )或是同樣屬於 NGS 的 454 定序儀(約 400bp),顯然是短了許多。因此 illumina 發展了 paired-end 的定序,先將 DNA 打斷成固定長度範圍的片段( 200~500bp ),再利用此技術讀取片段兩端的序列,我們即可得到 300bp ( 150x2 )的定序長度。此一技術不僅拉近了 illumina 和 454 之間的差距,也大大的改善了生物資訊的分析。

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